近日，中國藥科大學董廖斌課題組聯合南京大學張博副教授和美國佛羅里達大學Jeffrey Rudolf助理教授，獲得并解析了首個細菌來源II型倍半萜環化酶的晶體結構，破解了存在于II型萜類環化酶家族中數十年的催化機制難題——鎂離子結合簇，進而完整解析出該家族環化酶的詳細催化機制，相關研究成果以“Discovery, Structure, and Mechanism of a Class II Sesquiterpene Cyclase”為題發表在Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c09412）上。
萜類天然產物是自然界中數量最多，結構最多樣化的天然產物家族。萜類天然產物來源于不同長度的線性焦磷酸前體，而萜類環化酶負責催化該線性前體生成多環結構。根據不同的催化機制，序列及晶體結構，萜類環化酶可被分為兩類，即I型和II型萜類環化酶。I型萜類環化酶通過脫去焦磷酸基團形成碳正離子進而環化，該過程依賴鎂離子的參與。目前，已有報道超過30種 I型萜類環化酶的晶體結構，其中的鎂離子結合簇也得到了深入的研究，其主要位于焦磷酸基團周邊且與萜類環化酶的DDxxD及NSE/DTE催化基序有極性相關。但II型萜類環化酶的結構目前僅報道7例，其中5例的底物均具有焦磷酸基團；根據相關的生物化學體外酶學實驗，II型萜類環化酶通過質子化底物的末端雙鍵或者環氧基團形成碳正離子，不需脫去焦磷酸基團，但加入金屬鎂離子后，其催化效率呈現數千倍的增長，故有假設認為II型萜類環化酶中也存在一個鎂離子結合簇，以輔助底物結合于酶的活性空腔。但在此前報道的5個II型萜類環化酶結構中均未發現這一鎂離子結合簇。此外，在已有的7個II型萜類環化酶中，2個為三萜環化酶，4個為二萜環化酶，1個為雜萜環化酶，唯獨倍半萜環化酶的結構尚未報道。針對以上科學問題，董廖斌課題組開展了找尋II型倍半萜環化酶的研究工作。
首先，作者對角鯊烯-霍烷環化酶的PFAM數據庫進行篩查。根據已有的文獻報道，剔除已知的二萜環化酶及三萜環化酶及其相似基因的序列，得到45個潛在的II型倍半萜萜類環化酶基因。隨后，針對該45個環化酶的基因序列分析顯示，其中的12個基因具有 DxDD的保守催化基序；進一步結合基因組信息，發現其中的兩個酶A0A2P2GK84 (Streptomyces showdoensis)及F8JSS1 (Streptomyces cattleya)的上游緊鄰著一個Nudix水解酶，這一類型的水解酶曾報道于部分萜類的生物合成途徑中，發揮著單磷酸水解酶的作用。該基因組信息提示A0A2P2GK84及F8JSS1可能是潛在的單功能II型倍半萜環化酶。隨后通過體內異源表達實驗，作者成功獲得該酶的催化產物并將其鑒定為倍半萜drimenol，進一步體外生化表征實驗揭示其為II型萜類環化酶，并分別命名為SsDMS和ScDMS。
為了對該特殊的II型倍半萜環化酶進行深入的研究，作者通過篩選和優化結晶條件獲得了SsDMS的高質量apo-SsDMS（1.58 ?）及其復合物晶體結構。通過比較apo-SsDMS與經典的植物及細菌ent-copalyl diphosphate（ent-CPP）合酶發現，SsDMS是一個經典的以β結構域主導的βγ雙結構域環化酶，其催化酸基團D303及R403的位置相較于二萜和三萜環化酶更為偏上，擁有著更小的活性口袋，暗示SsDMS為天然的II型倍半萜環化酶。此外，針對催化酸基團的突變結果顯示該區域為催化過程中的關鍵位點。
通過比對SsDMS的復合物與apo-SsDMS結構，作者發現活性口袋中的多個氨基酸殘基在底物進入口袋后發生了位移，且在活性口袋中的焦磷酸基團附近發現了一個含有兩個鎂離子的金屬離子簇W165在apo狀態下，其側鏈位于底物的焦磷酸部分，而底物進入后，W165連帶相鄰的L166向外擴張使得香葉基焦磷酸（FPP）得以進入活性空腔，且原先位于活性口袋外的R132在底物進入后調轉側鏈使其與焦磷酸基團作用，而與鎂離子互作的外周谷氨酸E169的側鏈在底物進入后發生一定的翻轉，使其與鎂離子結合，從而起到錨定焦磷酸基團的作用。結合周邊與焦磷酸互作的氨基酸信息，作者針對這些氨基酸進行了定點突變，進一步驗證了這些氨基酸對于催化的重要性。更為重要的是，將E169突變為A或D后，SsDMS均失去了原有的活性，這表明與金屬離子互作的氨基酸側鏈長度起著關鍵作用。
基于以上研究結果，作者推測出該II型倍半萜合酶的完整催化機制，即在起始階段，底物FPP形成一個預折疊的狀態。底物FPP進入口袋時，W165與L166離開活性空腔；FPP進入后，R132翻轉與焦磷酸基團互作；D303質子化末端雙鍵產生碳正離子啟動環化過程；此時，口袋周邊的多個芳香性殘基穩定產生的碳正離子中間體。借助于距離C4位最近的水分子Wat47，聯合W393, Q497及Y505, Q497等殘基，共同完成最終的脫質子步驟，形成最終的環化產物。最后，Y307對D303重質子化從而開始下一輪環化。
中國藥科大學董廖斌課題組聯合南京大學張博副教授和美國佛羅里達大學Jeffrey Rudolf助理教授，通過基因組挖掘，發現隱藏于細菌基因組中的II型倍半萜合酶，獲得了該環化酶的晶體結構；在該酶的活性空腔中發現了一個特殊的含雙鎂離子的金屬離子簇及與其結合的谷氨酸殘基。該工作不僅確證了II型萜類環化酶真實存在著一個鎂離子結合簇，解決了II型萜類環化酶中的鎂離子結合簇難題，而且完整描繪出II型萜類環化酶的催化機制。此外，鎂離子結合簇的發現顯示出自然界選擇進化出的萜類環化酶的精巧催化之美，并體現出I型與II型萜類環化酶在進化過程中針對催化中心的靈活保留以完成不同的催化使命。
團隊簡介
董廖斌博士，教授、課題組長（PI）、博士生導師。入選“國家海外高層次人才引進計劃”青年項目、“江蘇特聘教授”以及江蘇省“雙創計劃”。2014年博士畢業于中國科學院昆明植物研究所，2014-2019年在美國斯克利普斯研究所從事博士后研究，并于2019年10月引進到中國藥科大學工作。迄今，以通訊及第一作者等在J. Am. Chem. Soc. (5篇), Nature Commun., Science, Nat. Chem. Biol.等期刊發表47篇論文，申請專利2項，主持國家自然科學基金面上項目等省部級項目4項。課題組主要從事萜類天然產物的發現、生物合成和合成生物學研究；歡迎有志于從事天然產物生物合成和“化學-酶”法合成的有機化學背景的青年才俊加入課題組。聯系方式：ldong@cpu.edu.cn.
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